Tajemnice rekonstrukcji skóry

W paryskim Muzeum Człowieka zorganizowano wystawę zatytułowaną „W mojej skórze”. Z tej okazji Marcelle Regnier – biolog, jedna z pionierów rekonstrukcji skóry in vitro, autorka licznych patentów w zakresie badań nad skórą – opowiada o historii swoich pasjonujących poszukiwań.

Skąd wziął się pomysł na badania nad rekonstrukcją skóry?

Wiele lat temu pracowałam w Krajowym Instytucie Zdrowia i Badań Medycznych (INSERM) w Lyonie, w zespole profesora Michela Prunierasa. Jego celem była próba znalezienia rozwiązań, które mogłyby pomóc w leczeniu osób ciężko poparzonych, jak np. uzyskanie w laboratorium podłoża umożliwiającego wzrost komórek naskórka ludzkiego. Zaczęliśmy od przeprowadzania licznych badań na kulturach komórkowych naskórka pozyskanych za pomocą biopsji.

Pierwszym problemem, który się pojawił, były ograniczenia w zakresie rozmnażania komórek. W tamtym czasie nie znano jeszcze techniki Howarda Greena z Massachusetts Institute of Technology, który w 1975 roku udowodnił, że keratynocytów nie należy hodować w izolacji, ale trzeba je łączyć z innymi komórkami (fibroblastami 3T3), co wiąże się z obecnością czynników wzrostu. Przed dokonaniem tego odkrycia możliwości uzyskiwania kultur komórkowych były bardzo ograniczone.

Innym problemem było znalezienie odpowiedniego podłoża, które pozwoliłoby przenosić wyhodowane komórki na poparzoną skórę. Przeprowadziliśmy mnóstwo badań z wykorzystaniem membran żelatynowych, ale efekty nie były zadowalające. W 1976 roku po powrocie ze Stanów Zjednoczonych prof. Prunieras zdecydował się zastosować technikę Alberta Freemana, która polegała na przełożeniu eksplantatu ludzkiej skóry na podłoże, a następnie na wystawieniu go na działanie powietrza, aby mogła się wytworzyć warstwa rogowa. Dzięki temu różnicowanie komórek naskórka przebiegało znacznie lepiej niż w przypadku, kiedy eksplantaty hodowano w płynie.

W późniejszym okresie w ramach współpracy z Fundacją Rothschilda rozszerzyliśmy w paryskim szpitalu Cochin zakres badań nad podłożem. Rezultaty były obiecujące: udało nam się uzyskać skórę właściwą, która mogła pokryć ranę, oraz kilka warstw komórek naskórka na powierzchni. Można już było wówczas pobierać małe fragmenty skóry osób poparzonych i na tej bazie prowadzić hodowlę komórek naskórka (autologicznych), po czym – kiedy wzrosły – przenosić je na uszkodzoną skórę pacjentów.

Wprowadzając czynniki wzrostu do hodowli, uzyskiwaliśmy znacznie lepsze efekty w odbudowie naskórka. Udało się w końcu uzyskać naskórek wielowarstwowy, jak w przypadku naturalnej skóry, pokryty warstwą rogową.

Następnie z zespołem laboratorium Episkin prowadziliśmy badania nad rekonstrukcją ludzkiej skóry na podłożu z kolagenu, 
a nie na pozbawionej naskórka skórze właściwej.

Rekonstruowana skóra znajduje zastosowanie nie tylko w medycynie, ale również w kosmetologii, gdzie służy do testowania kosmetyków. Dzięki temu można było odejść od prowadzenia testów na zwierzętach.

Rekonstruowana skóra znajduje zastosowanie nie tylko w medycynie, ale również w kosmetologii, gdzie służy do testowania kosmetyków. Dzięki temu można było odejść od prowadzenia testów na zwierzętach.

Pracowała pani również nad rekonstrukcją skóry o różnych odcieniach.

Z czasem, kiedy uzyskiwaliśmy już odpowiedni naskórek, można było wprowadzać do niego również inne komórki. Zaczęliśmy od melanocytów. I w tym wypadku wykorzystano wyniki badań zewnętrznych, tym razem przeprowadzonych przez Matta Olsona nad rozrostem hodowli melanocytów in vitro. Pokazały one, że można multiplikować melanocyty i hodować je wspólnie z keratynocytami w celu odbudowy zabarwionego naskórka. Użyliśmy melanocytów pozyskanych od dawców reprezentujących różne rasy, dzięki czemu zrekonstruowaliśmy naskórek w wielu odcieniach. Zabarwiony naskórek posłużył również do oceny wpływu promieniowania UV. Używaliśmy go także do testowania efektów ochronnych produktów przeciwsłonecznych. Modele naskórka okazały się bardzo funkcjonalne.

Początkowo mieliście wątpliwości co do funkcjonalności komórek hodowlanych?

To była wielka zagadka. Zastanawialiśmy się, czy się sprawdzą i w jakim zakresie. Nasze pytania wynikały z tego, że podczas zwiększania liczby komórek tracą one część cech funkcjonalnych, zdolność różnicowania się.

A więc nie wiadomo, czy będą zachowywać się tak, jak w naturze. Np. in vivo melanocyty w skórze nie rozmnażają się. Kiedy umieszcza się je w hodowli za pomocą techniki Matta Olsona w określonym środowisku, z określonymi czynnikami wzrostu, melanocyty zaczynają się rozmnażać. Tracą jednak część swoich cech, mogą np. dostarczać mniej melaniny. Łącząc je z keratynocytami i wprowadzając do odbudowanego naskórka, zwiększamy pigmentację: zachowują się więc one jak w naturalnej skórze. Nie mieliśmy tej obawy w przypadku keratynocytów, które w skórze rozmnażają się naturalnie. Nawet jeśli w sztucznej hodowli tracą niektóre cechy, to zachowują zdolność do różnicowania się. Eksponowanie hodowli keratynocytów na działanie powietrza uruchamia proces różnicowania bardzo zbliżony do tego, który można zaobserwować w naturalnej skórze, chociaż występują też różnice, jak np. większa przepuszczalność.

Efekty pracy nad zrekonstruowanym naskórkiem to zasługa pracy zbiorowej – szpitali leczących osoby ciężko poparzone i laboratoriów. Każdy wniósł swoją cząstkę doświadczenia i wiedzy, konfrontowaliśmy nasze hipotezy.

Czy podczas badań wprowadzano do zrekonstruowanego naskórka również innego rodzaju komórki naturalnie w nim obecne?

Do odbudowanego naskórka wprowadzaliśmy też komórki Langerhansa, które wywołują reakcje alarmowe w skórze, są w pewnym sensie strażnikami odporności. Te komórki prezentujące antygeny wychwytują obce substancje, które wnikają w skórę i przenoszą je do limfocytów T w węzłach chłonnych. Komórki Langerhansa uczestniczą głównie w reakcjach alergii kontaktowej lub uwrażliwienia, ale także w reakcjach alergicznych w przypadku nadmiernej ekspozycji na słońce. W tym wypadku współpracowaliśmy z zespołem Daniela Schmitta, dyrektora jednostki INSERM w Lyonie. Komórki Langerhansa są trudne do pozyskania ze skóry i nie rozmnażają się in vitro. Używaliśmy więc prekursorów tych komórek, które znajdują się we krwi pępowinowej (CD34+). Wprowadziliśmy je do odbudowanego naskórka i zauważyliśmy, że prekursory nabierały cech komórek Langerhansa występujących naturalnie w naskórku i wykazywały zbliżoną do nich funkcjonalność – reagowały na aplikowanie alergenów na powierzchnię odbudowanego naskórka. Uzyskanie immunowrażliwego naskórka to było ogromne wyzwanie. Wspólnie z Rainerem Schmidtem jako pierwsi udowodniliśmy, że jest to możliwe. Opracowanie tego modelu otwierało bardzo interesujące perspektywy dla analizowania pierwszych etapów reakcji w alergii kontaktowej. Ponadto zrekonstruowany zabarwiony naskórek zwierający komórki Langerhansa dawał możliwość badania immuno-farmako-toksykologicznego oraz badania interakcji komórkowych. Opublikowanie tych prac zostało zresztą docenione przez innych naukowców i uhonorowane okładką magazynu Journal of Investigative Dermatology.

Model zrekonstruowanej skóry
(naskórek i skóra właściwa) © I. Walter L’Oréal R&I

Zmiana pożywki
(centrum EpiSkin w Lyonie) © I. Walter L’Oréal R&I

Jakie wnioski wyciąga pani z tej długiej przygody?

Że byliśmy dobrzy! I że to zasługa pracy zbiorowej, zarówno szpitali leczących osoby ciężko poparzone, jak i laboratoriów. Każdy wniósł swoją cząstkę doświadczenia i wiedzy, konfrontowaliśmy hipotezy. Wyniki tych prac pozwoliły również ograniczyć prowadzenie testów na zwierzętach, zastępując je testami in vitro. Byliśmy wśród pierwszych, którzy pracowali nad komórkami macierzystymi, prekursorami komórek Langerhansa. Można by rzec, że otworzyliśmy drzwi do niektórych dziedzin. A jest jeszcze tyle do zrobienia, m.in. w kwestii komórek macierzystych naskórka czy w dziedzinie bioprintingu, czyli druku 3D do celów biologicznych. Wiele jeszcze przed nami.